项目所属科学技术领域：农业生物工程/中药资源。药用真菌(蘑菇)是祖国传统中医药的重要组成部分，现代生物技术、生物化学和药理学技术逐步揭示了传统药用真菌中防病治病的主要活性成分；这些活性物质中，多糖、萜类、甾醇类化合物等研究较多，蛋白类成分几乎为空白。本项目对接中药现代化和国家生物技术领域的国家重大战略需求，以灵芝研究对象，利用现代生物技术挖掘其功能基因，并对功能基因进行了系统的分析、评鉴和产业化应用基础研究，取得了以下成果：1、提出利用生物技术方法研究中草药中基因、蛋白和药理功能相互关系的新思想；建立了真菌免疫调节蛋白(fungal immunomodulatory proteins，FIPs)基因克隆、表达、功能验证的技术平台。首次发现并克隆了中国紫芝(G. sinensis)和黑灵芝(G.atrum)中真菌免疫调节蛋白基因FIP-gsi和FIP-gat，揭示了FIP-gsi和FIP-gat基因的结构和功能的关系；利用原核表达技术生产FIPs蛋白，建立了蛋白诱导表达和纯化的方法，通过小鼠脾细胞细胞因子诱导表达实验，证明了该蛋白的免疫调节功能并分析了其功能机制。2、成功地运用DNA改组技术对FIPs基因改组，为其体外生产合成和改善蛋白的生物学活性奠定基础。将FIPs基因根据其来源分成属内组和属间组，利用DNA shuffling技术对这两组基因在分子水平上进行重组，构建得到改组文库，利用斑点杂交技术和特异性抗体对改组文库进行筛选，共筛选426株属内重组菌株和412株属间组菌株。筛选并验证符合预期改组的突变体，表达与纯化蛋白并进行相关的生物活性实验分析验证，发现改组后的突变体，能够在细菌中表达并具有较好的免疫调节活性。3、以灵芝属内重组rFIP-SN15和黑灵芝rFIP-gat为例，初步揭示了该家族蛋白的抗肿瘤作用及其作用机制。通过MTT法筛选了rFIPs对不同肿瘤细胞的细胞毒性，发现了rFIPs对胶质瘤细胞U-251和乳腺癌细胞MDA-MB-231的直接抑制作用。在对rFIP抑制乳腺癌细胞MDA-MB-231的进一步实验中，通过流式细胞术和基因芯片技术、转录组测序技术等发现rFIPs对MDA-MB-231细胞增殖和细胞凋亡的作用规律，初步揭示了rFIPs诱导MDA-MB-231细胞凋亡的可能途径。4、把冬虫夏草看作是“一个统一微生态系统”，在国内外首次利用Illumina MiSeq高通量测序技术分析不同地理位置冬虫夏草在生长、成熟过程中的多菌共存共生的动态变化；分析了不同产地栖息地土壤、冬虫夏草、包裹虫体的菌膜等中微生物的多样性，揭示了“微生态系统”共生微生物种群的组成和结构；提出冬虫夏草菌Ophiocordyceps sinensis感染虫的过程为“多菌协同作用”的新思路。上述研究发表SCI论文46篇，在SCIE中共被他引624次，提交的8篇代表作SCIE他引259次，其中ESI高被引论文1篇；国际生物技术类顶尖级杂志Trends Biotechnol多次正面引用作者的成果。出版国家规划教材《生物技术概论》1本，参与编写国际专著《Edible and Medicinal Mushrooms: Technology and Application》，撰写Cultivation of Ganoderma lucidum；参与编写《中草药生物技术》1部。该研究为体外合成中草药蛋白类活性成分奠定了基础、应用生物技术研究中草药树立了典范，推动了我国中药现代化建设中生物技术应用的步伐。